PRIPREMA UZORAKA I HPLC ANALIZA METFORMINA U PLAZMI ŽENA SA SINDROMOM POLICISTIČNIH JAJNIKA

Sažetak

Poslednjih godina sindrom policističnih jajnika (PCOS) je uobičajena endokrinopatija koja pogađa približno 5% do 10% žena u reproduktivnoj dobi (1). Metformin (MTF) ili dimetil-bigvanid je oralni antidijabetik koji se takođe koristi u lečenju PCOS-a, ali njegovi terapijski režimi u tu svrhu još uvek nisu dobro standardizovani (2). Priprema uzoraka je važan korak u bioanalizi, a ekstrakcija MTF iz bioloških uzoraka donekle može biti komplikovana zbog polarne prirode ovog molekula. Ciljevi ovog istraživanja bili su optimizacija postupka pripreme uzoraka, kao i evaluacija i validacija HPLC metode za određivanje metformina u plazmi uzorkovanoj od žena sa PCOS. Uzorci krvne plazme sakupljeni su od žena sa PCOS (n=54), 2-3 sata nakon doziranja. Ekstrakcije su izvršene različitim polarnim organskim rastvaračima i vodenim rastvorima kiselina (metanol, etanol, acetonitril, 10% HClO₄, 10% trihlorosirćetna kiselina), nakon čega je usledilo centrifugiranje i filtriranje kroz membranski filter od 0,45 mm. Dvadeset mikrolitara supernatanta je injektovano na Zorbax-NH₂ kolonu i razdvajanje MTF je postignuto na 30°C izokratnim režimom rada. Mobilna faza se sastojala od 100% acetonitrila sa protokom od 0,725 mL/min. Detekcija je praćena na 232 nm, a kvantifikacija je izvršena metodom kalibracione krive. Nakon optimizacije eksperimentalnih uslova, najveće vrednosti za MTF (preko 92% od očekivanih) iz blank uzoraka plazme kojima je dodat standard određenih koncentracija dobijene su korišćenjem male zapremine acetonitrila. Za optimizovanu HPLC analizu, dobra linearnost je nađena u opsegu koncentracija od 0,1-5,0 μg/mL (r=0,9997), dok su limit detekcije i kvantifikacije iznosili 0,053 μg/mL i 0,175 μg/mL. Primenom odabranog postupka pripreme uzoraka i HPLC analize, određene koncentracije MTF u plazmi žena sa PCOS bile su u rasponu od 1,24±0,07 μg/mL do 2,38±0,17 μg/mL, dok je i preciznost bila zadovoljavajuća (RSD<8,5%). Predložena metoda zasnivala se jednostavnom postupku korišćenjem jednog organskog rastvarača i male zapremine prikupljenog biološkog uzorka, kao i na upotrebi jednostavne mobilne faze i polarne amino kolone. Ova kombinacija odabranih hromatografskih uslova omogućila je veoma kratko retenciono vreme za MTF (oko 3,7 min) i ukupno vreme jedne hromatografske analize za manje od 6 min. Takođe, dobijeni su i zadovoljavajući analitički parametri u smislu validacije za analizu MTF u plazmi žena sa PCOS.